Un péptido sintético se construye residuo a residuo, en un orden fijo, con un lavado entre cada paso. El método que lo hace práctico es la síntesis en fase sólida, y entenderlo explica varias cosas que después aparecen en un certificado de análisis: por qué el polvo lleva un contraión, por qué unas secuencias cuestan más que otras, y por qué la pureza hay que medirla en vez de suponerla.
El enlace que tiene que formarse, una y otra vez
Un enlace peptídico se forma cuando el grupo carboxilo de un aminoácido se une al grupo amino del siguiente, liberando agua. Por su cuenta la reacción es lenta y poco selectiva, así que en la práctica el carboxilo se activa químicamente primero, y todo grupo que no deba reaccionar se bloquea con un grupo protector. Cada ciclo de una síntesis es una versión pequeña y controlada de ese problema. Para el vocabulario de base, ver nuestra guía sobre aminoácidos, péptidos y proteínas.
Por qué anclar la cadena a una bolita lo cambió todo
En disolución, cada paso de una síntesis termina con una purificación, porque hay que separar el producto de todo lo demás del matraz. Unir la cadena en crecimiento a una resina insoluble elimina ese problema. El péptido se queda en la bolita, y reactivos y subproductos se lavan a través de un filtro. La idea se introdujo en 1963 y es la razón de que la síntesis de péptidos pueda automatizarse. (Referencia: Merrifield, 1963) (Referencia: Merrifield, 1985)
La resina decide cómo termina la cadena
El primer residuo no se ancla a la bolita directamente sino a través de un enlazador, y la química de ese enlazador determina cómo queda el extremo carboxilo al cortar el péptido. Un enlazador libera un ácido carboxílico; otro libera una amida. No es trivia de fabricación: las dos formas difieren en masa en torno a un dalton y son compuestos distintos, así que una especificación que dice que el extremo está amidado describe algo que una medición de masa puede confirmar o contradecir.
El ciclo
La síntesis corre del extremo carboxilo hacia el amino, al revés de como construye una proteína un ribosoma. Cada residuo añadido repite los mismos cuatro pasos:
- Desprotección. Se retira el grupo protector temporal del extremo libre de la cadena, dejando una amina lista para reaccionar.
- Lavado. Se arrastran reactivos y grupos protectores liberados.
- Acoplamiento. El siguiente aminoácido, activado en su carboxilo, forma el nuevo enlace.
- Lavado otra vez. El exceso de reactivo sale antes de empezar el ciclo siguiente.
Un péptido de veinte residuos es ese bucle repetido veinte veces. Nada se purifica por el camino.
Fmoc y Boc
Dominan dos estrategias de grupos protectores, nombradas por el grupo que protege el extremo amino entre ciclos. La química Boc lo retira con ácido. La química Fmoc lo retira con una base suave, lo que significa que los protectores de cadena lateral, que se quitan después con ácido, quedan intactos durante la síntesis. Esa separación de condiciones es lo que hace de Fmoc la opción habitual hoy. (Referencia: Carpino y Han, 1972) (Referencia: Chan y White, 1999)
Reactivos de acoplamiento y el costo de un paso incompleto
El reactivo que activa cada aminoácido decide qué tan completo queda el acoplamiento, y eso importa más de lo que suena. Si un acoplamiento va al 99 por ciento, una cadena de cada cien queda con un residuo de menos, y esa cadena acortada sigue por todos los ciclos restantes. El resultado es una secuencia de deleción: una molécula casi idéntica al objetivo, que difiere en un residuo. Los mejores reactivos de activación existen justo para empujar cada paso más cerca de completarse. (Referencia: Carpino, 1993)
Esas secuencias de deleción son las impurezas que un método de pureza tiene que resolver, y son la razón de que un pico pequeño pegado al principal en un cromatograma valga la pena mirarlo.
Comprobar un paso antes de seguir
Como nada se purifica entre ciclos, un acoplamiento fallido conviene detectarlo de inmediato. Desde 1970 se usa una prueba de color para grupos amino libres en la resina: las bolitas que aún llevan aminas sin reaccionar cambian de color, señal de que el acoplamiento no se completó. (Referencia: Kaiser et al., 1970)
El corte, y de dónde sale el contraión
Cuando la secuencia está completa, el péptido se corta de la resina y se retiran los protectores de cadena lateral, normalmente en un solo paso ácido con ácido trifluoroacético y una mezcla de capturadores que recoge los fragmentos reactivos liberados. Ahí entra en escena el trifluoroacetato por primera vez. Reaparece durante la purificación en fase reversa, y parte de él se queda con el material, que es la razón de que un péptido se aísle normalmente como sal y de que parte del polvo pesado sea contraión y no péptido.
Secuencias que se resisten
No todas se comportan. Las cadenas ricas en residuos hidrofóbicos pueden agregarse sobre la resina, plegándose sobre sí mismas de modo que el extremo reactivo queda físicamente bloqueado y los acoplamientos se atascan. Las síntesis largas agravan el problema, porque cada ciclo extra es otra oportunidad para una pérdida pequeña. Los procedimientos estándar y las modificaciones para secuencias difíciles están bien documentados. (Referencia: Coin et al., 2007)
Pasada cierta longitud, la síntesis por pasos deja de ser práctica. La respuesta habitual es construir dos fragmentos más cortos y unirlos químicamente, un enfoque que hizo posibles las proteínas totalmente sintéticas. (Referencia: Dawson et al., 1994)
Lo que sale de la resina no es el producto final
El material crudo contiene el objetivo, secuencias de deleción, cadenas mal desprotegidas y restos de la mezcla de corte. Se purifica, normalmente por cromatografía en fase reversa, y solo entonces se caracteriza: una corrida establece qué proporción es el objetivo, y la espectrometría de masas establece que el objetivo es la molécula pretendida. Esos dos resultados, ligados a un número de lote, son lo que reporta un certificado de análisis y lo que puedes contrastar con un vial que tengas en la mano.
Compruébalo contra un lote real
Cada compuesto del catálogo lleva su fórmula, su peso molecular y su número CAS, y cada lote que enviamos tiene un certificado que puedes buscar por número.
Preguntas frecuentes
¿Cómo se fabrican los péptidos de investigación?
Casi siempre por síntesis en fase sólida. El primer residuo se ancla a una resina insoluble y la cadena se extiende un aminoácido por vez mediante ciclos de desprotección, lavado y acoplamiento. Al final se corta de la resina y se purifica.
¿Por qué el péptido va unido a una resina?
Porque elimina la necesidad de purificar después de cada paso. La cadena se queda en el soporte sólido mientras reactivos y subproductos se lavan a través de un filtro, que es lo que hace el proceso repetible y automatizable.
¿Qué diferencia hay entre síntesis Fmoc y Boc?
En cómo se retira el protector temporal del extremo amino. Boc usa ácido; Fmoc usa una base suave, dejando intacta la protección de cadena lateral hasta el final. Esa separación de condiciones hace de Fmoc la opción más común.
¿Qué es una secuencia de deleción?
Una cadena a la que le faltó un residuo porque un acoplamiento no se completó, y que siguió por los ciclos restantes. Es casi idéntica al objetivo y difiere en un solo residuo, lo que la convierte en la impureza más difícil de resolver.
¿Por qué un péptido sintético contiene trifluoroacetato?
El ácido trifluoroacético se usa para cortar el péptido de la resina y de nuevo como aditivo en la purificación en fase reversa. Parte queda asociado al material, así que el péptido suele aislarse como sal y parte del polvo pesado es contraión.
¿Por qué unas secuencias son más difíciles que otras?
Las hidrofóbicas pueden agregarse sobre la resina y bloquear físicamente el extremo reactivo, atascando los acoplamientos. La longitud además acumula pérdidas pequeñas, porque cada ciclo adicional es otra oportunidad para un paso incompleto.
Referencias
- Merrifield, R.B. (1963). Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide. Journal of the American Chemical Society, 85(14), 2149-2154.
- Merrifield, R.B. (1985). Solid Phase Synthesis (Nobel Lecture). Angewandte Chemie International Edition, 24(10), 799-810.
- Carpino, L.A., & Han, G.Y. (1972). The 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino-protecting group. The Journal of Organic Chemistry, 37(22), 3404-3409.
- Chan, W.C., & White, P.D. (1999). Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. Oxford University Press.
- Carpino, L.A. (1993). 1-Hydroxy-7-azabenzotriazole. An efficient peptide coupling additive. Journal of the American Chemical Society, 115(10), 4397-4398.
- Kaiser, E., Colescott, R.L., Bossinger, C.D., & Cook, P.I. (1970). Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Analytical Biochemistry, 34(2), 595-598.
- Coin, I., Beyermann, M., & Bienert, M. (2007). Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nature Protocols, 2(12), 3247-3256.
- Dawson, P.E., Muir, T.W., Clark-Lewis, I., & Kent, S.B.H. (1994). Synthesis of proteins by native chemical ligation. Science, 266(5186), 776-779.