La espectrometría de masas mide la relación masa-carga de moléculas ionizadas. En trabajo con péptidos responde una pregunta que ninguna cifra de pureza responde por sí sola: ¿es esta la molécula correcta? Un cromatograma dice cuánto hay de una cosa. Un espectro de masas dice cuánto pesa esa cosa y, por tanto, qué es probablemente.

Qué mide el instrumento

Un espectrómetro de masas hace tres cosas en secuencia. Convierte moléculas neutras en iones, separa esos iones según su relación masa-carga, y los cuenta. La salida es un espectro: intensidad frente a m/z. Nada en ese proceso pesa una molécula directamente. Lo que se mide es cómo se comporta un ion en un campo eléctrico o magnético, y de ahí se infiere la masa. (Referencia: Aebersold y Mann, 2003)

Cómo un péptido se convierte en ion

Los péptidos son grandes, frágiles y no volátiles, lo que los hizo muy difíciles de analizar hasta que dos métodos de ionización resolvieron el problema a finales de los ochenta.

  • Ionización por electrospray (ESI). La muestra se pulveriza desde una aguja fina a alto voltaje. El disolvente se evapora de las gotas hasta dejar iones desnudos en fase gaseosa. Como trabaja desde disolución, el ESI se acopla directo a un cromatógrafo de líquidos. (Referencia: Fenn et al., 1989)
  • Desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI). La muestra se cocristaliza con una matriz que absorbe luz y recibe un pulso láser. La matriz absorbe la energía y arrastra al péptido consigo a la fase gaseosa. (Referencia: Karas y Hillenkamp, 1988)

La diferencia práctica aparece en el espectro. El MALDI suele producir iones de una sola carga, así que el espectro es simple de leer. El ESI produce una serie de iones multicargados de la misma molécula, y el software combina esa serie en una masa. Un espectro con varios picos igualmente espaciados no son varios compuestos: es uno solo llevando distinto número de protones.

Masa monoisotópica y masa promedio

Un certificado que reporta una masa observada está reportando uno de dos números distintos, y no son intercambiables.

La masa monoisotópica se calcula con el isótopo más ligero y abundante de cada elemento: carbono-12, hidrógeno-1, nitrógeno-14, oxígeno-16. La masa promedio pondera cada elemento por la abundancia natural de todos sus isótopos. Para un péptido pequeño las dos difieren en bastante menos de un dalton. A medida que la molécula crece la brecha se abre, porque hay más átomos de carbono disponibles para cargar un isótopo pesado. (Referencia: Senko et al., 1995)

Por eso una masa observada que queda a un dalton de lo esperado no es automáticamente un problema. Puede ser la misma molécula reportada con el otro criterio. Y por eso también un buen certificado dice qué masa está citando.

Las configuraciones que verás nombradas

Tres combinaciones cubren casi todo el análisis de péptidos, y un certificado suele nombrar una.

  • MALDI-TOF. Ionización láser con analizador de tiempo de vuelo, que separa iones por el tiempo que tardan en recorrer una distancia fija. Rápido, tolerante a sales y adecuado para confirmar la masa de una muestra purificada.
  • ESI-MS. Electrospray alimentando el analizador directo desde disolución. La elección natural cuando la muestra ya está en líquido.
  • LC-MS/MS. Cromatografía líquida delante, espectrometría en tándem detrás. El cromatógrafo separa, el primer analizador selecciona un componente y el segundo mide sus fragmentos. Es la configuración que da separación, masa y evidencia de secuencia en una sola corrida.

Espectrometría en tándem y la secuencia

Medir la molécula entera confirma su masa. No confirma el orden de los residuos, y dos secuencias distintas construidas con los mismos aminoácidos pesan exactamente igual. La espectrometría en tándem cierra ese hueco: selecciona un ion, lo rompe y mide los pedazos.

Los péptidos tienden a romper por el esqueleto amida, produciendo dos familias de fragmentos: una serie que conserva el extremo amino y otra que conserva el carboxilo. La convención para nombrarlos es estándar desde 1984, y la diferencia entre fragmentos consecutivos corresponde al residuo que se perdió. Leyendo la serie, la secuencia aparece sola. (Referencia: Roepstorff y Fohlman, 1984) (Referencia: Domon y Aebersold, 2006)

Con qué se combina, y por qué

La HPLC separa y cuantifica, pero no nombra. Dos compuestos pueden salir de la columna a tiempos parecidos y un detector UV reporta ambos como picos, sin opinión. La espectrometría de masas nombra, pero por sí sola no dice qué proporción representa cada componente. Juntas como LC-MS cubren el punto ciego de la otra, y por eso un certificado de análisis completo trae un resultado de cada una. (Referencia: Yates et al., 2009)

Qué no puede decirte

  • Los isómeros pesan igual. Leucina e isoleucina tienen masas de residuo idénticas, así que una medición estándar no distingue secuencias que solo se diferencien en cambiar una por otra.
  • La estereoquímica es invisible. Un aminoácido D y su contraparte L pesan lo mismo. Nada en el espectro los separa.
  • La altura del pico no es concentración. Moléculas distintas ionizan con eficiencia distinta, así que la intensidad no se traduce en cantidad sin un patrón de referencia.
  • Ve lo que se ioniza. Sales, agua y contraiones que forman parte del polvo pesado no aparecen como aparece el péptido.

Dónde encaja en el registro de un lote

Para un péptido sintético la secuencia habitual es directa. Se fabrica el material, se purifica, una corrida cromatográfica establece qué proporción es el objetivo, y una medición de masa establece que el objetivo es la molécula pretendida. Los dos resultados, ligados a un número de lote, son lo que convierte una etiqueta en algo comprobable. Puedes consultar el lote de un vial en nuestra página de verificación. (Referencia: Aebersold y Mann, 2016)

Compruébalo contra un lote real

Cada compuesto del catálogo lleva su fórmula, su peso molecular y su número CAS, y cada lote que enviamos tiene un certificado que puedes buscar por número.

Preguntas frecuentes

¿Qué mide la espectrometría de masas en péptidos?

La relación masa-carga de moléculas ionizadas. De ahí se infiere la masa molecular y se compara con la calculada a partir de la secuencia pretendida, que es lo que confirma la identidad.

¿Qué diferencia hay entre MALDI y ESI?

El MALDI ioniza desde una matriz sólida golpeada por láser y suele dar iones de una sola carga, así que el espectro es simple. El ESI ioniza desde disolución y da una serie de iones multicargados que el software combina en una masa. El ESI se acopla directo a cromatografía líquida; el MALDI no.

¿Qué diferencia hay entre masa monoisotópica y promedio?

La monoisotópica usa el isótopo más ligero y abundante de cada elemento. La promedio pondera cada elemento por la abundancia natural de todos sus isótopos. Difieren en bastante menos de un dalton en péptidos pequeños y la brecha se abre al crecer la molécula, así que el certificado debería decir cuál reporta.

¿Puede confirmar la secuencia de un péptido?

La espectrometría en tándem sí. Selecciona un ion, lo fragmenta por el esqueleto y mide los pedazos. La diferencia entre fragmentos consecutivos corresponde al residuo perdido, así que la secuencia se lee a lo largo de la serie.

¿Qué no detecta la espectrometría de masas?

No distingue isómeros de igual masa, como leucina e isoleucina, y no ve la estereoquímica. La intensidad del pico tampoco se traduce en concentración, porque moléculas distintas ionizan con distinta eficiencia.

¿Por qué la pureza sin medición de masa está incompleta?

La pureza cromatográfica reporta cuánto del material detectado es un componente principal, pero no establece que ese componente sea la molécula correcta. Emparejar pureza con una medición de identidad es lo que completa un certificado.

Referencias

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